附件3：

體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導原則

——核酸檢測試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導原則

（征求意見稿）

核酸擴增檢測技術(shù)泛指以擴增DNA或RNA為手段，從而篩查特定基因的檢測技術(shù)，如聚合酶鏈反應（PCR）、連接酶鏈反應（LCR）、轉(zhuǎn)錄依賴的擴增反應（TMA）等。核酸檢測試劑是基于核酸擴增檢測技術(shù)的體外診斷試劑，目前已經(jīng)用于病原體檢測、特定疾病的早期診斷和體內(nèi)物質(zhì)的型別鑒定等不同領(lǐng)域。為規(guī)范核酸檢測試劑的生產(chǎn)及質(zhì)量控制，特制定本技術(shù)指導原則，并將根據(jù)核酸檢測技術(shù)的發(fā)展狀況適時進行修改。

一、基本要求

1、核酸類檢測試劑的生產(chǎn)企業(yè)應獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。

2、核酸類檢測試劑的生產(chǎn)企業(yè)應具有與其技術(shù)要求相適應的人員、環(huán)境、設(shè)施和儀器設(shè)備等條件，建立專用實驗室，配備滿足核酸提取和擴增檢測以及操作人員防護所需的設(shè)備。實驗室應當嚴格分區(qū)，人員和物品應當單向流動，以最大限度地防止實驗過程中樣品之間的污染和避免擴增產(chǎn)物的污染。

3、核酸類檢測試劑的生產(chǎn)企業(yè)應按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實施細則（試行）》的要求，建立相應的質(zhì)量管理體系，并應通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

4、核酸類檢測試劑的生產(chǎn)單位應當對試劑的使用范圍作出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品管理部門批準。引物設(shè)計應當符合核酸檢測設(shè)計的要求，擴增體系應設(shè)定合理的內(nèi)標和外標，試劑須設(shè)置抗污染的特定措施，擴增產(chǎn)物須進行確證研究。

5、核酸類檢測試劑的原材料應制訂相關(guān)質(zhì)量標準，應符合現(xiàn)行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》的要求。使用未列入上述標準的化學試劑，應不低于分析純。

二、原材料

應提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標準品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標準等的相關(guān)研究資料。如果主要原材料來自市場（從其他單位購買），應提供的資料包括：對物料供應商審核的相關(guān)資料、購買合同、供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無DNase和RNase污染。

1、dNTP

脫氧三磷酸核苷，核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應為HPLC純、PCR級，無DNase和RNase污染。-20℃保存。

2、引物

由一定數(shù)量的核苷酸構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，1800D以上。序列正確。純度應達到電泳級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶。應提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

應作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6~2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3、探針

是指特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端標記熒光素報告基團或其他發(fā)光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，90D以上。純度應達到HPLC純，不含雜帶。應提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發(fā)光物進行核實，并作HPLC分析。應以可見—紫外分光光度計進行200~800nm掃描，在260nm處應有吸收峰。另外，根據(jù)標記的熒光素的不同，還應該在熒光素的激發(fā)波長處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4、Taq DNA聚合酶

具有DNA聚合酶活性，無核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5、UNG（尿嘧啶糖基化酶）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，IU UNG在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模版應完全降解，不能產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。-20℃保存。

6、RT-PCR酶（反轉(zhuǎn)錄擴增酶）

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃1小時后仍保持50%活性，-20℃保存。

三、生產(chǎn)工藝

核酸類檢測試劑的基本生產(chǎn)工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對pH、電導率等關(guān)鍵

參數(shù)進行有效控制。

工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內(nèi)容如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質(zhì)控方法、

臨界值的確定、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)。

四、質(zhì)量控制

（一）半成品質(zhì)量控制

1、按批號抽取規(guī)定數(shù)量的半成品。

2、以參考品／對照品進行半成品質(zhì)量控制。如果產(chǎn)品具有國家標準品或參考品，應以其進行檢定。如果產(chǎn)品不具有國家標準品或參考品，應根據(jù)規(guī)定制備相應的參考品，或以經(jīng)標化的質(zhì)

粒進行半成品檢定。

3、半成品檢定內(nèi)容包括：對照品符合率、靈敏度、特異性、

精密度。結(jié)果應符合要求。

4、半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時進行分裝和包裝。

（二）成品質(zhì)量控制

1、產(chǎn)品完成包裝后，應根據(jù)生產(chǎn)量進行抽樣和生產(chǎn)記錄審

核。

2、以參考品／對照品或參考品，或以經(jīng)標化的質(zhì)粒進行成

品質(zhì)量檢驗。結(jié)果應符合要求。

3、成品檢驗的內(nèi)容應包括：對照品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線性和穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗可采用加速破壞試驗。